Molecular diagnosis of cerebral toxoplasmosis: comparing markers that determine Toxoplasma gondii by PCR in peripheral blood from HIV-infected patients

As cerebral toxoplasmosis is the most common cerebral focal lesion in AIDS patients, this study evaluated three PCR markers for diagnosis, since some limitations remain present, such as low parasite levels in some clinical samples. The molecular markers were B22-B23 and Tg1-Tg2 (based on the B1 gene) and Tox4-Tox5 (non-coding fragment, repeated 200-300-fold). DNA samples from 102 AIDS patients with previously known diagnosis were analyzed. The cerebral toxoplasmosis group was constituted of DNA extracted from the blood of 66 AIDS patients, which was collected before or until the third day of the therapy for toxoplasmosis. DNA from the blood of 36 AIDS patients with other neurologic opportunistic infections was used as control group. Sensitivities of B22-B23, Tg1-Tg2, and Tox4-Tox5 markers were of 95.5 percent, 93.9 percent, and 89.3 percent, respectively. In the control group, the specificities were of 97.2 percent (B22-B23), 88.9 percent (Tg1-Tg2), and 91.7 percent (Tox4-Tox5). The association of at least two markers increased the PCR sensitivity and specificity. The concordance index between two markers varied from 83.3 percent to 93.1 percent. These data demonstrated that all markers evaluated here were highly sensitive for T. gondii determination, although B22-B23 has been shown to be the best. The association of two markers increases PCR sensitivity, but the procedure was more expensive and time-consuming.

Diagnóstico molecular da toxoplasmose cerebral: comparação de diferentes marcadores utilizados na PCR para detecção de Toxoplasma gondii em pacientes com aids / Molecular diagnosis of cerebral toxoplasmosis: comparison of different markers used in PCR for detection of Toxoplasma gondii in aids patients

Introdução: A toxoplasmose cerebral é uma das lesões focais cerebrais de maior importância em pacientes com aids. Este estudo teve como objetivo aprimorar o diagnóstico molecular da toxoplasmose cerebral. Métodos: Esta dissertação foi dividida em 2 partes: Uma retrospectiva, para PCR convencional (cnPCR), onde avaliou-se 2 marcadores moleculares de T. gondii (TG1-TG2 tendo como alvo um fragmento do gene B1 e TOX4-TOX5, um fragmento da região repetitiva de 529 pb); A outra, prospectiva, onde padronizou-se e validou-se 2 protocolos de PCR em tempo real qualitativa (qrtPCR) utilizando-se os marcadores B1TgF-B1TgR e RETgF-RETgR tendo como alvo, também, o gene B1 e o fragmento de 529 pb. Em ambas as etapas do estudo, o método controle foi a cnPCR utilizando-se o marcador B22-B23. Resultados: Na primeira etapa foram analisadas 102 amostras de DNA extraídas de sangue provenientes de pacientes com aids e com diagnóstico clínico já estabelecido. Destes, 66 possuíam toxoplasmose cerebral e 36, outras infecções oportunistas. Comparando os resultados dos 2 marcadores estudados com o B22-B23, obtiveram-se sensibilidades de 95.5%, 93.9% e 89.3%; especificidades de 97.2%, 88.9% e 91.7% para B22- B23, TG1-TG2 e TOX4-TOX5 respectivamente. A associação de pelo menos 2 marcadores aumentou a sensibilidade e especificidade. Os índices de concordância entre 2 marcadores variou de 83.3% a 93.1%. Apesar de todos os marcadores apresentarem boa sensibilidade na detecção de T. gondii, B22-B23 ainda foi o melhor. A associação de 2 marcadores aumentou a sensibilidade, porém demandou mais tempo e custo. Na segunda parte foram analisadas 149 amostras de DNA extraídas de sangue e liquidocefalorraquidiano provenientes de pacientes com aids, e achados clínicos e radiológicos conhecidos. O diagnóstico laboratorial incluiu cnPCR (B22-B23), imunofluorescência indireta e duas qrtPCR (B1Tg e RETg) com o sistema TaqMan probe FAM dye-labeled. A sensibilidade...

Diagnóstico molecular da toxoplasmose cerebral: comparação de diferentes marcadores utilizados na PCR para detecção de Toxoplasma gondii em pacientes com aids

Introdução: A toxoplasmose cerebral é uma das lesões focais cerebrais de maior importância em pacientes com aids. Este estudo teve como objetivo aprimorar o diagnóstico molecular da toxoplasmose cerebral. Métodos: Esta dissertação foi dividida em 2 partes: Uma retrospectiva, para PCR convencional (cnPCR), onde avaliou-se 2 marcadores moleculares de T. gondii (TG1-TG2 tendo como alvo um fragmento do gene B1 e TOX4-TOX5, um fragmento da região repetitiva de 529 pb); A outra, prospectiva, onde padronizou-se e validou-se 2 protocolos de PCR em tempo real qualitativa (qrtPCR) utilizando-se os marcadores B1TgF-B1TgR e RETgF-RETgR tendo como alvo, também, o gene B1 e o fragmento de 529 pb. Em ambas as etapas do estudo, o método controle foi a cnPCR utilizando-se o marcador B22-B23. Resultados: Na primeira etapa foram analisadas 102 amostras de DNA extraídas de sangue provenientes de pacientes com aids e com diagnóstico clínico já estabelecido. Destes, 66 possuíam toxoplasmose cerebral e 36, outras infecções oportunistas. Comparando os resultados dos 2 marcadores estudados com o B22-B23, obtiveram-se sensibilidades de 95.5%, 93.9% e 89.3%; especificidades de 97.2%, 88.9% e 91.7% para B22- B23, TG1-TG2 e TOX4-TOX5 respectivamente. A associação de pelo menos 2 marcadores aumentou a sensibilidade e especificidade. Os índices de concordância entre 2 marcadores variou de 83.3% a 93.1%. Apesar de todos os marcadores apresentarem boa sensibilidade na detecção de T. gondii, B22-B23 ainda foi o melhor. A associação de 2 marcadores aumentou a sensibilidade, porém demandou mais tempo e custo. Na segunda parte foram analisadas 149 amostras de DNA extraídas de sangue e liquidocefalorraquidiano provenientes de pacientes com aids, e achados clínicos e radiológicos conhecidos. O diagnóstico laboratorial incluiu cnPCR (B22-B23), imunofluorescência indireta e duas qrtPCR (B1Tg e RETg) com o sistema TaqMan probe FAM dye-labeled. A sensibilidade...